在莱奥纳尔多即将结束他的米兰生活时，他试图用画《博士来访》的方法创作湿壁画《最后的晚餐》。这幅画为米兰圣玛丽亚修道院食堂而作。莱奥纳尔多从1495动笔，花了四年时间仍未完成。修道院的修士难免着急，便去向米兰大公抱怨。米兰大公将修道院的怨言转告画家，莱奥纳尔多不假思索地辩解说，艺术家不是工匠，他需要充分的时间工作，因为需要等待灵感。他又说，画中的人物颇费心思选择，特别是出卖耶稣的犹大的形象，更使人费神。不过，修道院里那位告状的修士的面相，大可作“犹大”的模型。这番话逗得大公捧腹大笑，而那位修士生怕画家果真把他作了叛徒犹大的模特儿，也就默然离去了。其实，莱奥纳尔多并不想故意拖延时间，他需要充裕的时间完成他的绘画创举。有一位目击者告诉我们，他经常去看莱奥纳尔多绘制《最后的晚餐》。他看到画家经常爬上脚手架，整天整天地紧抱双臂，挑剔地审视已经画出的部分，经过深思熟虑之后，才画出下一笔。所谓湿壁画，要求画家趁墙上所涂的石灰未干时，一次性画完一个部分。为了避免湿壁画的局限性，莱奥纳尔多实验了新的媒介，这种媒介像油画一样，允许画家同时画整个画面。不幸的是，这种新的媒介不能耐久，在莱奥纳尔多生前，《最后的晚餐》画面已开始剥落龟裂。

　　《最后的晚餐》可谓多灾多难。除了它本身的材质问题之外，人为的破坏更使这幅人间杰作至今已面目全非。这幅画画在修道院餐厅长方形大堂一端的墙面上，画完不久，修道院要在食堂与厨房之间开一扇门，就在画面正下方开了一个洞，正好裁去画中耶稣及其他三位使徒的脚。后来曾有画家补画过两次，但都不甚高明。拿破仑攻入意大利时，把这大厅作了马厩，士兵们向画中人物头部投掷石头为戏，更摧残了这幅举世名作。

　　然而，严重的残损并没能抹煞莱奥纳尔多在这幅作品中留下的创新证据。统观全画，我们立刻会注意到整个构图平衡、稳定。细观片刻，我们会发现这种平衡是由调解画中人物和建筑之间的冲突而获得的。在早期文艺复兴绘画中，建筑往往有压倒人物之势。莱奥纳尔多在绘制“最后的晚餐”场景时，尽管严格遵守各项透视规则，但他从设计人物构图入手，从一开始就将画中建筑当作辅助部分。莱奥纳尔多充分利用建筑来突出主要人物，他把全画的透视灭点定在处于画面中心基督的头部后面，加强其象征含义。基督头后所画的窗户也具有明显的象征功能，窗上的山墙弧形线暗示了神圣的光环。这些建筑场景好像是为配合画中人物所演出的戏剧而存在。如果我们遮挡住画面上部分，画中人物构图看上去就会像一条饰带，使徒人物的组合立刻失去了清晰性，而呈三角形的基督形象也会显得冷漠被动，失去原有的吸引我们注意力、震撼我们灵魂的力量。

　　这幅画触击我们心灵的力量，来自于莱奥纳尔多抓住了这幕悲剧中的悬念时刻：救世主基督刚刚说出致命的话：“我实在告诉你们，你们中间有一个人要出卖我了。”听了这话，使徒们突然骚扰惶惑，一个一个地问他，“主，是我吗？”这一瞬间，就像一块巨石扔进了平静的湖水，泛起层层波浪，引起了整个画面的运动。

　　顺便说一下，莱奥纳尔多精心研究过水的运动，据艺术史家考证，莱奥纳尔多在安排《最后的晚餐》中人物姿态的运动关系时运用了他对水流的研究结果。在莱奥纳尔多之前，有许多画家画过“最后的晚餐”，在那些画中，十二使徒通常安静地在餐桌旁坐成一排，基督正在平静地分发圣餐，为让观者轻易地认出叛徒犹大，画家们总是特意将他与其他使徒隔离开来。莱奥纳尔多的《最后的晚餐》与众不同。他的画中有戏剧、有骚动，还要表现出各个人物颜面上的复杂表情。

　　刚听了救世主的启示，他身边的使徒个个惊魂落魄。有些人的姿态仿佛在表示其清白与敬爱，有些人好像在严肃地争论主说的可能是谁，还有一些人则好像在等待主解释话的意思。圣彼得性急，冲向坐在主右边的圣约翰，与他悄声耳语，无意之中把犹大微微地推向我们观众的视野。犹大虽然没有与其他人明显分隔开来，但他好像处于孤立的地位，使我们观者看清他紧紧地攥着出卖基督而得来的钱袋。在整个顿时骚乱的场景中，只有基督听凭自然地坐在那里，稳如惊涛骇浪拍击中的磐石。

　　在西方绘画史上，以前从来没有艺术家能那么接近、那么逼真地把这个宗教故事呈现在我们观者的眼前。然而，如果我们认为，画家只是为了表现这一悲剧瞬间而创作了这幅壁画，那我们就误解了他的意图。任何熟悉基督教圣餐礼的人都能看出，画中基督姿态的主要含义是顺从上帝的意志和奉献。在耶稣指出是犹大出卖了他之后，故事的下文是：“他们吃的时候，耶稣拿起饼来，祝福，就掰开，递给门徒，说：‘你们拿着吃，这是我的身体。’

　　“又拿起杯来，祝谢了，递给他们，说：‘你们都喝这个，因为这是我立约的血，为多人流出来，使罪得赦。’”(马太福音26-29)

　　这个故事中有两个高潮，第一个是耶稣告诉使徒有人出卖了他，第二个是耶稣说“这是我的身体，这是我的血。”这即是“最后的晚餐”的核心意义，比前一个高潮更重要。但前一个高潮更富于现实的表现性，因此莱奥纳尔多选择了这个情节。然而，莱奥纳尔多的伟大之处就在于让我们经历了那番情感骚动之后，并没有使我们忘记故事的整个意义。画面中的使徒不单单是在对主的话作出反应，每一个使徒都流露出他的个性，表现出他与救世主的关系。画中的人物典型地说明了莱奥纳尔多在笔记中记下的格言：绘画的最高目标就是要通过人的姿态和四肢的运动描绘人的灵魂意图。艺术家不仅要表现转瞬即逝的情感状态，而且要揭示人的整个内心生活。